สารกำจัดวัชพืชทำงานโดยการแทรกแซงกระบวนการทางสรีรวิทยาและชีวเคมีของวัชพืชผ่านสารเคมี ซึ่งนำไปสู่การยับยั้งการตายหรือการเจริญเติบโต กลไกการออกฤทธิ์ของสารกำจัดวัชพืชมีความหลากหลาย โดยหลักๆ ได้แก่:
1. การรบกวนการสังเคราะห์ด้วยแสง: ตัวอย่างเช่น สารกำจัดวัชพืชไตรอาซีนปิดกั้นห่วงโซ่การขนส่งอิเล็กตรอนสังเคราะห์ด้วยแสง ทำให้วัชพืชตายเนื่องจากไม่สามารถสังเคราะห์พลังงานได้
2. การยับยั้งการสังเคราะห์กรดอะมิโน: ตัวอย่างเช่น ไกลโฟเสตยับยั้งการสังเคราะห์ EPSP ซึ่งขัดขวางการสังเคราะห์กรดอะมิโนอะโรมาติก
3. การหยุดชะงักของการแบ่งเซลล์: ตัวอย่างเช่น สารกำจัดวัชพืชไดไนโตรอะนิลีนยับยั้งการสร้างไมโครทูบูล ป้องกันการแบ่งเซลล์
4. การเลียนแบบฮอร์โมนพืช: ตัวอย่างเช่น 2,4-D กระตุ้นการเจริญเติบโตมากเกินไป ส่งผลให้วัชพืชมีรูปร่างผิดปกติและตายไป การเลือกสรรของสารกำจัดวัชพืชขึ้นอยู่กับความแตกต่างทางเมตาบอลิซึมระหว่างพืชผลและวัชพืช สารกำจัดวัชพืชที่ไม่คัดเลือกมีผลในการฆ่าพืชทุกชนิด
